ワクチンのスパイクはコロナと同じ

2022/01/23 21:15

……ってことは？

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8538446/
『SARS–CoV–2 Spike Impairs DNA Damage Repair and Inhibits V(D)J Recombination In Vitro
SARS-CoV-2スパイクはin vitroでDNA損傷修復を阻害し、V(D)J組換えを抑制する

Hui Jiang 1,2,* and Ya-Fang Mei 2,*

1スウェーデン、ストックホルム、SE-10691、ストックホルム大学、ウェナー–グレン研究所分子生物科学科
2ウメオ大学ウイルス学臨床微生物学科、SE-90185ウメオ、スウェーデン

ウイルス. 2021 Oct; 13(10): 2056.
2021年10月13日オンライン公開 doi: 10.3390/v13102056
pmcid: pmc8538446
PMID：34696485』
より

Abstract

Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS–CoV–2) has led to the coronavirus disease 2019 (COVID–19) pandemic, severely affecting public health and the global economy. Adaptive immunity plays a crucial role in fighting against SARS–CoV–2 infection and directly influences the clinical outcomes of patients. Clinical studies have indicated that patients with severe COVID–19 exhibit delayed and weak adaptive immune responses; however, the mechanism by which SARS–CoV–2 impedes adaptive immunity remains unclear. Here, by using an in vitro cell line, we report that the SARS–CoV–2 spike protein significantly inhibits DNA damage repair, which is required for effective V(D)J recombination in adaptive immunity. Mechanistically, we found that the spike protein localizes in the nucleus and inhibits DNA damage repair by impeding key DNA repair protein BRCA1 and 53BP1 recruitment to the damage site. Our findings reveal a potential molecular mechanism by which the spike protein might impede adaptive immunity and underscore the potential side effects of full-length spike-based vaccines.

概要
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）はコロナウイルス病2019（COVID-19）のパンデミックを引き起こし、公衆衛生と世界経済に深刻な影響を及ぼしています。適応免疫は、SARS-CoV-2感染との戦いに重要な役割を果たし、患者の臨床転帰に直接影響を及ぼします。しかし、SARS-CoV-2がどのようなメカニズムで適応免疫の働きを阻害しているのかは、いまだ不明である。今回、我々はin vitroの細胞株を用いて、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質が、適応免疫において有効なV（D）J組換えに必要なDNA損傷修復を著しく阻害することを報告した。その結果、スパイクタンパク質は核内に局在し、DNA修復の鍵となるタンパク質BRCA1や53BP1の損傷部位への移動を阻害することで、DNA損傷修復を阻害することが分かった。この結果は、スパイクタンパク質が適応免疫を阻害する潜在的な分子機構を明らかにし、スパイクを用いた完全長ワクチンの副作用の可能性を明確にするものである。

1. Introduction
Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS–CoV–2) is responsible for the ongoing coronavirus disease 2019 (COVID–19) pandemic that has resulted in more than 2.3 million deaths. SARS–CoV–2 is an enveloped single positive–sense RNA virus that consists of structural and non–structural proteins [1]. After infection, these viral proteins hijack and dysregulate the host cellular machinery to replicate, assemble, and spread progeny viruses [2]. Recent clinical studies have shown that SARS–CoV–2 infection extraordinarily affects lymphocyte number and function [3,4,5,6]. Compared with mild and moderate survivors, patients with severe COVID–19 manifest a significantly lower number of total T cells, helper T cells, and suppressor T cells [3,4]. Additionally, COVID–19 delays IgG and IgM levels after symptom onset [5,6]. Collectively, these clinical observations suggest that SARS–CoV–2 affects the adaptive immune system. However, the mechanism by which SARS–CoV–2 suppresses adaptive immunity remains unclear.

1. はじめに
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）は、現在進行中のコロナウイルス病2019（COVID-19）パンデミックの原因であり、230万人以上の死者を出している。SARS-CoV-2は、構造タンパク質と非構造タンパク質からなるエンベロープ型シングルポジティブセンスRNAウイルスである[1]。感染後、これらのウイルスタンパク質は、宿主の細胞機構を乗っ取って制御不能にし、子孫ウイルスを複製、組み立て、拡散させます[2]。最近の臨床研究により、SARS-CoV-2感染は、リンパ球の数と機能に非常に大きな影響を与えることが示されている[3,4,5,6]。軽度および中等度の生存者と比較して、重度のCOVID-19患者は、総T細胞、ヘルパーT細胞、およびサプレッサーT細胞の数が著しく少ないことが明らかになりました[3,4]。さらに、COVID-19は、症状発現後のIgGおよびIgMレベルを遅延させる[5,6]。これらの臨床的観察を総合すると、SARS-CoV-2が適応免疫系に影響を与えることが示唆される。しかし、SARS-CoV-2が適応免疫を抑制する機構は、まだ不明である。

As two critical host surveillance systems, the immune and DNA repair systems are the primary systems that higher organisms rely on for defense against diverse threats and tissue homeostasis. Emerging evidence indicates that these two systems are interdependent, especially during lymphocyte development and maturation [7]. As one of the major double-strand DNA break (DSB) repair pathways, non-homologous end joining (NHEJ) repair plays a critical role in lymphocyte–specific recombination–activating gene endonuclease (RAG) –mediated V(D)J recombination, which results in a highly diverse repertoire of antibodies in B cell and T cell receptors (TCRs) in T cells [8]. For example, loss of function of key DNA repair proteins such as ATM, DNA–PKcs, 53BP1, et al., leads to defects in the NHEJ repair which inhibit the production of functional B and T cells, leading to immunodeficiency [7,9,10,11]. In contrast, viral infection usually induces DNA damage via different mechanisms, such as inducing reactive oxygen species (ROS) production and host cell replication stress [12,13,14]. If DNA damage cannot be properly repaired, it will contribute to the amplification of viral infection-induced pathology. Therefore, we aimed to investigate whether SARS–CoV–2 proteins hijack the DNA damage repair system, thereby affecting adaptive immunity in vitro.

免疫系とDNA修復系は、宿主を監視する重要なシステムとして、高等生物が多様な脅威に対する防御と組織の恒常性を保つために依存している主要なシステムである。
この2つのシステムは、特にリンパ球の発生と成熟の間、相互に依存していることを示す新たな証拠が得られている[7]。主要な二本鎖DNA切断（DSB）修復経路の一つとして、非相同末端結合（NHEJ）修復は、リンパ球特異的な組み換え活性化遺伝子エンドヌクレアーゼ（RAG）を介したV（D）J組み換えに重要な役割を果たし、B細胞における抗体やT細胞におけるTCRの非常に多様なレパートリーとなっている [8]．例えば、ATM、DNA-PKcs、53BP1などの主要なDNA修復タンパク質の機能喪失は、機能的なB細胞やT細胞の生産を阻害するNHEJ修復の欠陥につながり、免疫不全を引き起こします[7,9,10,11]。一方、ウイルス感染は、通常、活性酸素種（ROS）産生の誘導や宿主細胞の複製ストレスなど、異なるメカニズムでDNA損傷を誘発する[12,13,14]。DNA損傷が適切に修復されないと、ウイルス感染によって引き起こされる病態の増幅に寄与することになる。そこで、我々はSARS-CoV-2タンパク質がDNA損傷修復システムを乗っ取り、それによって適応免疫に影響を与えるかどうかをin vitroで調べることを目的とした。

（中略）

3.2. SARS–CoV–2 Spike Protein Inhibits DNA Damage Repair
Because spike proteins are critical for mediating viral entry into host cells and are the focus of most vaccine strategies [20,21], we further investigated the role of spike proteins in DNA damage repair and its associated V(D)J recombination. Spike proteins are usually thought to be synthesized on the rough endoplasmic reticulum (ER) [1]. After posttranslational modifications such as glycosylation, spike proteins traffic via the cellular membrane apparatus together with other viral proteins to form the mature virion [1]. Spike protein contains two major subunits, S1 and S2, as well as several functional domains or repeats [22] (Figure 2A). In the native state, spike proteins exist as inactive full–length proteins. During viral infection, host cell proteases such as furin protease activate the S protein by cleaving it into S1 and S2 subunits, which is necessary for viral entry into the target cell [23]. We further explored different subunits of the spike protein to elucidate the functional features required for DNA repair inhibition. Only the full–length spike protein strongly inhibited both NHEJ and HR repair (Figure 2B–E and Figure S4A,B). Next, we sought to determine whether the spike protein directly contributes to genomic instability by inhibiting DSB repair. We monitored the levels of DSBs using comet assays. Following different DNA damage treatments, such as γ–irradiation, doxorubicin treatment, and H2O2 treatment, there is less repair in the presence of the spike protein (Figure 2F,G). Together, these data demonstrate that the spike protein directly affects DNA repair in the nucleus.

3.2. SARS-CoV-2スパイクタンパク質はDNA損傷修復を阻害する
スパイクタンパク質は、ウイルスの宿主細胞への侵入を媒介するのに重要であり、ほとんどのワクチン戦略の焦点となっているため[20,21]、我々はさらにDNA損傷修復とそれに伴うV（D）J組み換えにおけるスパイクタンパク質の役割を調査しました。スパイクタンパク質は、通常、粗面小胞体で合成されると考えられています[1]。スパイクタンパク質は、糖鎖修飾などの翻訳後修飾を受けた後、他のウイルスタンパク質とともに細胞膜装置を経由して成熟したウイルスを形成する[1]。スパイクタンパク質は、S1とS2という2つの主要なサブユニットと、いくつかの機能ドメインまたはリピートを含んでいる[22] (図2A)。スパイクタンパク質は、本来の状態では、不活性な全長タンパク質として存在する。ウイルス感染時には、宿主細胞のプロテアーゼ（furinプロテアーゼなど）がSタンパク質をS1サブユニットとS2サブユニットに切断して活性化し、ウイルスが標的細胞に侵入するのに必要な働きをします[23]。我々はさらに、DNA修復阻害に必要な機能的特徴を明らかにするために、スパイクタンパク質の異なるサブユニットを探索した。完全長のスパイクタンパク質だけが、NHEJとHR修復の両方を強く阻害した（図2B-Eおよび図S4A,B）。次に、スパイクタンパク質がDSB修復を阻害することによって、ゲノムの不安定性に直接寄与しているかどうかを調べた。コメットアッセイを用いて、DSBのレベルをモニターした。γ線照射、ドキソルビシン処理、H2O2処理などの異なるDNA損傷処理後、スパイクタンパク質が存在すると修復が少なくなる（図2F,G）。これらのデータから、スパイクタンパク質は核内のDNA修復に直接影響を与えることが明らかになった。

3.3. Spike Proteins Impede the Recruitment of DNA Damage Repair Checkpoint Proteins
To confirm the existence of spike protein in the nucleus, we performed subcellular fraction analysis and found that spike proteins are not only enriched in the cellular membrane fraction but are also abundant in the nuclear fraction, with detectable expression even in the chromatin–bound fraction (Figure 3A). We also observed that the spike has three different forms, the higher band is a highly glycosylated spike, the middle one is a full–length spike, and the lower one is a cleaved spike subunit. Consistent with the comet assay, we also found the upregulation of the DNA damage marker, γ–H2A.X, in spike protein–overexpressed cells under DNA damage conditions (Figure 3B). A recent study suggested that spike proteins induce ER stress and ER–associated protein degradation [24]. To exclude the possibility that the spike protein inhibits DNA repair by promoting DNA repair protein degradation, we checked the expression of some essential DNA repair proteins in NHEJ and HR repair pathways and found that these DNA repair proteins were stable after spike protein overexpression (Figure 3C). To determine how the spike protein inhibits both NHEJ and HR repair pathways, we analyzed the recruitment of BRCA1 and 53BP1, which are the key checkpoint proteins for HR and NHEJ repair, respectively. We found that the spike protein markedly inhibited both BRCA1 and 53BP1 foci formation (Figure 3D–G). Together, these data show that the SARS–CoV–2 full–length spike protein inhibits DNA damage repair by hindering DNA repair protein recruitment.

3.3. スパイクタンパク質はDNA損傷修復チェックポイントタンパク質のリクルートメントを阻害している
核内におけるスパイクタンパク質の存在を確認するため、細胞内画分解析を行ったところ、スパイクタンパク質は細胞膜画分に濃縮されているだけでなく、核内画分にも豊富に存在し、クロマチン結合画分でも検出可能な発現が確認された（図3A）。また、スパイクには3種類の形態があり、高い方のバンドは高度にグリコシル化されたスパイク、真ん中のバンドは全長のスパイク、下のバンドは切断されたスパイクのサブユニットであることが観察された。コメットアッセイと同様に、スパイクタンパク質を過剰発現させた細胞では、DNA損傷マーカーであるγ-H2A.XがDNA損傷条件下で発現上昇することも見いだした（図3B）。最近の研究では、スパイクタンパク質が小胞体ストレスと小胞体関連タンパク質分解を誘導することが示唆されている[24]。
スパイクタンパク質がDNA修復タンパク質の分解を促進することでDNA修復を阻害している可能性を排除するために、NHEJとHR修復経路に必須ないくつかのDNA修復タンパク質の発現を確認したところ、これらのDNA修復タンパク質はスパイクタンパク質過剰発現後も安定していることがわかった（図3C）。
スパイクタンパク質がどのようにしてNHEJとHR修復経路の両方を阻害するのかを明らかにするために、HRとNHEJ修復の重要なチェックポイントタンパク質であるBRCA1と53BP1のそれぞれのリクルートメントを分析した。その結果、スパイクタンパク質はBRCA1と53BP1の両方のフォーカスの形成を著しく阻害することがわかった（図3D-G）。これらのデータから、SARS-CoV-2全長スパイクタンパク質は、DNA修復タンパク質の動員を阻害することにより、DNA損傷修復を阻害することがわかった。

3.4. Spike Protein Impairs V(D)J Recombination In vitro
DNA damage repair, especially NHEJ repair, is essential for V(D)J recombination, which lies at the core of B and T cell immunity [9]. To date, many approved SARS–CoV–2 vaccines, such as mRNA vaccines and adenovirus–COVID–19 vaccines, have been developed based on the full–length spike protein [25]. Although it is debatable whether SARS–CoV–2 directly infects lymphocyte precursors [26,27], some reports have shown that infected cells secrete exosomes that can deliver SARS–CoV–2 RNA or protein to target cells [28,29]. We further tested whether the spike protein reduced NHEJ–mediated V(D)J recombination. For this, we designed an in vitro V(D)J recombination reporter system according to a previous study [18] (Figure S5). Compared with the empty vector, spike protein overexpression inhibited RAG–mediated V(D)J recombination in this in vitro reporter system (Figure 4).

3.4. スパイクタンパク質はin vitroでV(D)J組換えを阻害する
DNA損傷修復、特にNHEJ修復は、B細胞やT細胞免疫の中核をなすV(D)J組み換えに必須である[9]。現在までに、mRNAワクチンやアデノウイルス-COVID-19ワクチンなど、承認された多くのSARS-CoV-2ワクチンが、完全長のスパイクタンパク質をベースに開発されている[25]。SARS-CoV-2 がリンパ球前駆細胞に直接感染するかどうかは議論の余地があるが [26,27] 、感染細胞がエクソソームを分泌し、SARS-CoV-2 RNA やタンパク質を標的細胞に送達できることを示す報告もある [28,29]．さらに、スパイクタンパク質が NHEJ を介した V(D)J 組換えを減少させるかどうかを検証した。このために、我々は以前の研究[18]に従ってin vitro V(D)J組換えレポーター系を設計した（図S5）。空ベクターと比較して、スパイクタンパク質の過剰発現は、このin vitroレポーターシステムにおいて、RAGを介したV(D)J組み換えを阻害した（図4）。

4. Discussion
Our findings provide evidence of the spike protein hijacking the DNA damage repair machinery and adaptive immune machinery in vitro. We propose a potential mechanism by which spike proteins may impair adaptive immunity by inhibiting DNA damage repair. Although no evidence has been published that SARS–CoV–2 can infect thymocytes or bone marrow lymphoid cells, our in vitro V(D)J reporter assay shows that the spike protein intensely impeded V(D)J recombination. Consistent with our results, clinical observations also show that the risk of severe illness or death with COVID–19 increases with age, especially older adults who are at the highest risk [22]. This may be because SARS–CoV–2 spike proteins can weaken the DNA repair system of older people and consequently impede V(D)J recombination and adaptive immunity. In contrast, our data provide valuable details on the involvement of spike protein subunits in DNA damage repair, indicating that full–length spike–based vaccines may inhibit the recombination of V(D)J in B cells, which is also consistent with a recent study that a full–length spike–based vaccine induced lower antibody titers compared to the RBD–based vaccine [28]. This suggests that the use of antigenic epitopes of the spike as a SARS–CoV–2 vaccine might be safer and more efficacious than the full–length spike. Taken together, we identified one of the potentially important mechanisms of SARS–CoV–2 suppression of the host adaptive immune machinery. Furthermore, our findings also imply a potential side effect of the full–length spike–based vaccine. This work will improve the understanding of COVID–19 pathogenesis and provide new strategies for designing more efficient and safer vaccines.

4. 考察
今回の発見は、in vitroにおいてスパイクタンパク質がDNA損傷修復機構と適応免疫機構を乗っ取る証拠を提供するものである。我々は、スパイクタンパク質がDNA損傷修復を阻害することによって、適応免疫に障害を与える可能性のあるメカニズムを提案する。SARS-CoV-2が胸腺細胞や骨髄リンパ球に感染するという証拠は発表されていないが、我々のin vitro V(D)J reporter assayはスパイク蛋白がV(D)J組み換えを強く阻害することを示している。我々の結果と一致して、臨床観察でもCOVID-19による重症化または死亡のリスクは年齢とともに増加し、特に高齢者が最もリスクが高いことが示されている[22]。これは、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質が高齢者のDNA修復システムを弱め、結果としてV(D)J組み換えと適応免疫を阻害するためと思われる。対照的に、我々のデータは、DNA損傷修復におけるスパイクタンパクサブユニットの関与に関する貴重な詳細を提供し、完全長スパイクベースのワクチンは、B細胞におけるV（D）Jの組換えを阻害する可能性を示し、これは、完全長スパイクベースのワクチンは、RBDベースのワクチンと比較して低い抗体価を誘導するという最近の研究とも一致している[28]。このことは、スパイクの抗原性エピトープをSARS-CoV-2ワクチンとして使用することが、全長のスパイクよりも安全で効果的である可能性を示唆している。以上のことから、我々はSARS-CoV-2が宿主の適応免疫機構を抑制する潜在的に重要なメカニズムの一つを明らかにした。さらに、我々の発見は、完全長スパイクベースのワクチンの潜在的な副作用を示唆するものでもある。この研究により、COVID-19の病原性の理解が深まり、より効率的で安全なワクチン設計のための新しい戦略が得られると期待される。